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Master
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Práctica
nº 4.
Aislamiento de hongos ectomicorrícicos en cultivo puro
Introducción El inóculo
vegetativo que se obtiene a partir de cultivo puro de hongos, es de gran interés,
ya que nos garantiza la inoculación con una especie concreta y en condiciones
estériles. De esta manera, se evitan riesgos de contaminaciones en los
viveros que impidan el desarrollo adecuado de las micorrizas; por otro lado
presenta la desventaja de ser un método costoso, y complicado de desarrollar
si no se dispone del instrumental necesario, y la producción a gran escala no
puede hacerse si no se dispone de equipamiento adecuado.
Objetivos El
alumno será capaz de llevar a la práctica las técnicas indispensables para
la síntesis de micorrizas: aislamiento
de hongos en cultivo puro.
Material
y equipamiento indispensable
Alcohol de 70º
Alcohol de 96º
Bisturí / Asa de siembra
Cámara de flujo laminar
Cámara de incubación
Esporocarpos de distintas
especies
Mascarilla
Mechero de alcohol Parafilm Placas Petri con medio de cultivo
Protocolo 1.-
Introducir un mechero encendido en la cámara de flujo laminar y dejar encendida
la lámpara de rayos U.V.A un cuarto de hora antes de comenzar a trabajar para
asegurar condiciones estériles 2.-
Limpiar bien los carpóforos de cualquier resto que pudiese quedar en la cutícula
y situarlos en la cámara de flujo laminar 3.-
Para realizar el aislamiento del micelio de las especies de Boletales,
Agaricales y Russulales, se procede del siguiente modo: se divide
longitudinalemnte un carpóforo inmaduro con un bisturí previamente lavado en
alcohol de 70º y esterilizado en la llama. Se corta una pequeña muestra de la
zona estéril situada entre la cutícula y el himenio: Se abre al lado de la
llama una placa con medio de cultivo, se deposita la muestra y se cierra rápidamente.
Cada mitad puede volver a seccionarse para extraer una nueva muestra del carpóforo.
En
todo este proceso, es muy importante:
-
Que el tejido cortado no lleve restos de cutícula ni de himenio, ya que en
ambos casos existirían riesgos de contaminación del cultivo (la cutícula y el
himenio no son estériles).
-
Lavar el bisturí y el asa de siembra en alcohol y posteriormente esterilizar en
la llama antes y despues de cada uso.
En el
caso de los Gasterales, si queremos aislar su micelio en cultivo puro, es
especialmente necesario que los carpóforos estén inmaduros, no deben presentar
aún esporas. El procedimiento es el mismo pero el tejido estéril se extrae del
interior del carpóforo, de la zona central.
El
riesgo de contaminaciones a la hora de obtener este tipo de inóculo es bastante
elevado, por lo que es necesario trabajar siempre extremando las condiciones de
esterilidad. 4.- Se
sellan las placas con parafilm y con un rotulador se anota en la parte superior
o inferior de la placa el nombre de la especie y la fecha en que fue sembrada.
5.- Se
introducen las placas en una cámara incubadora a 25 ºC en oscuridad para que
crezcan los micelios 6.-
Transcurrida una semana, eliminar las placas contaminadas, y a los 20 días
resembrar cada micelio en nuevas placas. De este
modo obtendremos cultivo puro de hongos ectomicorrícicos que se podrán usar
como fuente de tejidos fúngicos para la elaboración de diferentes formas de inóculo
micelial.
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Fuente: Esquema de Brundet & al. 1996 modificado
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