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Práctica 2. Estudio macroscópico y microscópico de micorrizas
Introducción
El tipo
de micorrizas y la valoración del grado de colonización de las raíces
micorrizadas requiere el estudio de caracteres macroscópicos y microscópicos
de las micorrizas: presencia de arbúsculos y vesículas en VAM; y vaina , red
de Hartig, color, ramificación, etc… en ectomicorrizas.
Objetivos
1-
Observar e Identificar las características morfológicas de ectomicorrizas,
tanto a nivel macroscópico (p. ej. ramificación) como microscópico (anatomía:
características del manto, tipo de red, …) y endomicorrizas
2-
Valorar el grado de colonización de las raíces micorrizadas.
Material
necesario
Ø
Colorante
Ø
Cubreobjetos
Ø
Cuchilla
Ø
HCl
0.1 N
Ø
KOH
al 10 %
Ø
Lactoglicerol
Ø
Lupa
binocular
Ø
Microscopio
óptico
Ø
Pinzas
Ø
Placas
Petri con base reticulada
Ø
Portaobjetos
Ø
Raíces
micorrizadas
Ø
Tubos
de ensayo
A. ESTUDIO DE ECTOMICORRIZAS
1.
MORFOLOGÍA EXTERNA
En
primer lugar se observará la morfología externa de las ectomicorrizas; se podrá
apreciar el aspecto, color, tipo de ramificación, ect.. de las micorrizas
en las raíces infectadas. Así mismo podrán observarse los rizomorfos
(hifas emanantes del manto, alargadas y con fines exploratorios para la obtención
de nutrientes) y los esclerocios
(formas de resistencia del hongo).
Método de observación
Colocar
distintas muestras de raíces micorrizadas sobre una placa Petri bajo la lupa
teniendo cuidado de que esté sobrenadando ligeramente en agua para una mejor
observación
|
|
|
2. MORFOLOGÍA INTERNA DE LAS ECTOMICORRIZAS
Objetivos
1.-
Se procederá a observar un corte transversal para apreciar las dos estructuras
(manto y red de Hartig) que caracterizan a este tipo de micorrizas,
2.-
Se realizará una observación más detallada del manto para ver su estructura
Método
de observación: Hacer varios cortes transversales muy finos (del grosor del
filo de la cuchilla) sobre un portaobjetos bajo la lupa, añadir una gota de
agua y observar al microscopio
En un
corte transversal de una ECM se puede apreciar:
Vaina
o manto: conjunto de hifas del hongo
rodeando a la raíz
Red de Hartig:
hifas que a partir del manto penetran interiormente en la raíz disponiéndose
entre las células epidérmicas (red epidérmica) y en muchos casos también
penetrando entre las células corticales (red cortical)
Fuente:
Ilustración de Brundet & col.
2.- Es
interesante observar la estructura del manto ya que sus características anatómicas
sirven para la identificación de ectomicorrizas recolectadas en el campo.
Existen
dos tipos básicos: plectenquimáticos
y pseudoparenquimáticos.
Método
de observacióndel manto: Se extrae un pequeño fragmento del manto de una
ECM con unas pinzas o con la cuchilla, se depositará sobre un portaobjetos añadiendo
una gota de agua y se observa al microscopio
Dibujo
Esquemático de los tipos de manto. A-I Mantos plectenquimáticos. K-Q Mantos
pseudoparenquimáticos (Smith y Read, 1997)
B.
OBSERVACIÓN ENDOMICORRIZAS
La
observación de micorrizas VAM resulta más complicada ya que este tipo de
micorrizas no presentan estructuras externas que evidencien su existencia, como
es el caso de la vaina en las ECM. Por lo tanto, para poder comprobar que una raíz
está micorrizada con hongos VAM es necesario recurrir a la tinción y observación
microscópica de la misma. Así mismo, se puede estimar fácilmente el
porcentaje de colonización radicular.
TINCIÓN
DE MICORRIZAS ARBUSCULARES
Preparación
de las raíces:
1.
Se lavan las raíces de la planta con el fin de eliminar los restos suelo
que aún permanece unidos a ellas.
2.
Se corta la parte aérea de la planta justo en el punto donde comienzan
las raíces.
3.
Se introducen las raíces en un tubo de ensayo.
4.
Para favorecer la visualización de las hifas, vesículas y arbúsculos
del hongo micorrizógeno, se debe someter a la raíz a un proceso de aclarado
que deberá durar más o menos tiempo en función del tipo de raíz (más cuanto
más vieja sea, mayor cantidad de materias tánicas contenga etc.)
4.1.
Cubrir las raíces con una solución KOH al 10%.
4.2.
Calentar los tubos con las raíces durante 20 minutos (más tiempo si éstas son
gruesas o tienen mucho tanino, ya que necesitarán un mayor aclarado).
4.3.
Una vez enfriados los tubos se elimina la solución y se vuelven a lavar las raíces
con agua.
4.4.
Echamos nuevamente en el tubo, cubriendo las raíces, una solución de HCl (0,1
N), para neutralizar el KOH que haya podido quedar en la raíz.
4.5.
Dejamos actuar durante 2 minutos y eliminamos el líquido. Si la raíz no
ha quedado blanca (por ejemplo, mantiene colores amarillentos) habrá que
repetir el proceso de aclarado, dejando actuar más tiempo al KOH.
5.
Tinción Utilizaremos un colorante específico para teñir las hifas del
hongo (Azul Tripan 0,05%, Clorazol Negro, Fucsina etc.)
5.1.
Bañamos las raíces del tubo con el colorante (Azul Tripan 0,05% en
lactoglicerol) y calentamos durante 5 minutos.
5.2.
Después sacamos los tubos y dejamos enfriar.
5.3.
Eliminamos el colorante y añadimos lactoglicerol para quitar el exceso,
mezclando bien y haciendo que salga el colorante.
5.4.
La operación se repite hasta que las raíces no tiñan el lactoglicerol.
Fuente:
Ilustración de Brundet & col.
DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE COLONIZACIÓN RADICULAR:
1.
Una
vez lavadas las raices ECM o teñidas las raíces VA, se extienden
aleatoriamente sobre una placa de Petri que tiene dibujada una rejilla. La
rejilla puede tener el tamaño de cuadrícula que deseemos pero es conveniente
que el lado de cada cuadro mida 1,3 cm.
2.
A continuación observamos de manera cuidadosa y ordenada cada una de las
líneas verticales y horizontales
que conforman la rejilla, anotando:
 |
1.
Los contactos que se producen entre las raíces y las líneas
anteriores. |
|
2.
Los puntos anteriores que además de contacto (intersección),
presentan colonización por un hongo (ya sea ECM o hifa, arbúsculo o vesícula
en VAM). Un ajuste más fino nos obligaría a separar cada uno de estos
tipos de contacto. |
3.
Se calcula el sumatorio de todas las intersecciones producidas y de todas
aquellas que además contaban con presencia fúngica.
4. El porcentaje de colonización radicular (CR) se obtiene a partir del cociente: Ni / Ti, siendo Ni = número de intersecciones infectivas, y Ti = Total de intersecciones producidas.
