MEDIO SÓLIDO MMN (Melin Norkrans modificado)

NOTA: 1ml= 20 gotas. 0.1 ml= 2 gotas

Lo más adecuado es utilizar fuentes puras de sales inorgánicas y complementos nutritivos orgánicos, pero para facilitar la elaboración, emplearemos soluciones stock ya preparadas. A pesar de ello, se requiere una balanza de precisión para pesar algunos ingredientes y pHmetro, que debe emplearse al final del proceso para ajustar el pH final. El agar se añade para solidificar el medio en el grado deseado. Finalmente es necesaria la esterilización en autoclave.

Protocolo

1.- Para preparar el medio MMN, se añaden con una pipeta en un vaso de precipitados los seis primeros componentes en el orden en el que aparecen reflejados en la tabla  y la disolución se mantiene en un agitador para una correcta homogeneización de la mezcla.

2.- A continuación se añade la tiamina.

3.- Posteriormente se incorporan la glucosa y el extracto de malta, y se añaden por orden a la disolución, siempre manteniéndola en el agitador.

4.- Medimos el pH de la disolución que ha de ser de 5.5. Si no es así debemos corregirlo con una disolución ácida o básica según proceda.

5.- Una vez corregido el pH, se procede a añadir el agar. La disolución así obtenida se vierte sobre un Erlenmeyer en el que previamente habremos incorporado el agar y se agita vigorosamente para favorecer su disolución.

6.- Por último, se añade el agua destilada y se agita de nuevo.

MEDIO SÓLIDO PDA (Potato Dextrosa Agar)

Para la elaboración del medio PDA, el procedimiento es mucho más sencillo puesto que ya está comercializado en polvo y sólo es necesario disolverlo en  agua destilada (en las proporciones adecuadas) y agitar.

7.- Simultáneamente podemos esterilizar papeles de filtro del diámetro de una placa Petri (que pueden ser empleados para realizar una posterior inoculación vegetativa) y los introducimos dentro de una placa de vidrio (que resiste la Tª del autoclave) para su esterilización junto con el medio

8.- Una vez preparadas las disoluciones y antes de proceder a su utilización, es necesario esterilizarlas en autoclave (15-20 minutos a 121º C).

La esterilización se realiza para asegurar que el medio preparado no contenga microorganismos ni otros contaminantes. Podemos esterilizar el medio directamente en el Erlenmeyer colocándole un algodón hidrófobo y papel de aluminio para taparlo, o bien verterlo en recipientes con tapadera a rosca de Pyrex que resisten la esterilización y son más manejables. Si se opta por esta segunda opción, es necesario tomar la precaución de dejar la tapadera un poco floja para que la presión interna del autoclave no reviente los recipientes.

9.- Los medios esterilizados hay que mantenerlos en un baño a 50-60 º C durante unos 30 minutos para bajar la temperatura.

Preparación de los envases para el cultivo

10.- El siguiente paso es verter el medio en placas Petri para posteriormente cultivar los hongos que nos interesan. Esto se realiza en condiciones totalmente estériles, dentro de una cámara de flujo laminar  con un  mechero encendido al que se aproxima el recipiente con el medio, mientras que con la otra mano se acerca la placa Petri, se abre al lado de la llama y se vierte en ella un poco de medio, cerrándose inmediatamente. Este proceso se repite hasta terminar el medio preparado. Posteriormente se procederá a realizar el cultivo puro del hongo que nos interese (ver práctica nº 4)

11.- En algunos casos, y con la finalidad de obtener inóculo vegetativo en filtro, es necesario colocar papel de filtro sobre el medio cuando éste está todavía líquido para que el papel se embeba de medio y así luego haremos crecer ahí el micelio del hongo que nos interese. Para ello, acercamos la placa a la llama, abrimos e introducimos en ella un filtro con la ayuda de unas pinzas pasadas previamente por alcohol de 70º y por la llama (para evitar contaminaciones), y cerramos inmediatamente.